Mussafia studierte zunächst vier Semester Medizin. Beschäftigte sich dann autodidaktisch mit der romanischen Philologie und knüpfte dabei an den Arbeiten von Friedrich Diez an, dessen bedeutendster und universalster Nachfolger er wurde. Von 1855 an lehrte er — seit 1867 als Ordinarius — an der Universität Wien romanische Sprachen und war, obwohl österreichischer Staatsangehöriger, Förderer der politischen Interessen Italiens. Sein wissenschaftliches Ansehen brachte ihm mehrere Rufe nach auswärtigen Universitäten ein, die er jedoch alle ablehnte, während er die Mitgliedschaft der Akademien von Wien, Berlin, Rom, Paris und Madrid akzeptierte.

Sein Arbeitsgebiet umfaßte alle Forschungsgebiete der romanischen Sprachen unter historischen Gesichtspunkten: Phonetik, Morphologie, Syntax, Dialektologie. Daneben beschäftigte ihn das mittelalterliche Legendengut Italiens. Unter seinen bald deutsch, bald italienisch geschriebenen Arbeiten ist die wichtigste: "Monumenti antichi dei dialetti italiani", erschienen 1864.