Pflüger studierte Medizin in Marburg und Berlin, war Schüler von Du Bois-Reymond. 1858 Privatdozent der Physiologie in Berlin. 1859 bis zu seinem Lebensende Ordinarius der Physiologie in Bonn.

Seine Hauptbeiträge betreffen die Physiologie des Nervensystems, der Blutgase, der Verbrennungsvorgänge in lebenden Organismen und des Eiweiß- und Kohlenhydratstoffwechsels.

Pflüger war Gründer und langjähriger Herausgeber der einflußreichen Zeitschrift "Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere". Seine kritischen Kommentare in dieser Zeitschrift waren oft von ungewöhnlicher Schärfe.