Seit 1829 leitender Arzt der Chirurgischen Klinik des Charité-Krankenhauses in Berlin, 1832 außerordentlicher, 1841 ordentlicher Professor für Chirurgie an der Universität Berlin.

Dieffenbach war einer der führenden Chirurgen seiner Zeit, der sich vor allem durch die Verbesserung der chirurgischen Technik verdient gemacht hat. Er entwickelte neue Methoden im Gebiet der plastischen Chirurgie, der Tenotonie — einer Sehnendurchschneidung zum Verbessern der fehlerhaften Stellung eines Gelenks — sowie der orthopädischen Nachbehandlung der Patienten. Er führte die operative Therapie des Schielens an der Charité ein und erwarb sich große Verdienste um die Anwendung der Bluttransfusion. Durch experimentelle Untersuchungen offenbarte er die Möglichkeiten und Grenzen von Transplantationen.

Dieffenbach legte seine klinischen Erfahrungen in den Standardwerken "Die Transfusion des Blutes und der Infusion der Arzneimittel in die Blutgefäße" (1828), "Über die Durchschneidung der Sehnen und Muskeln" (1841) und "Die operative Chirurgie" (1845-1848) nieder.