Nach dem Studium an der Berliner Musikakademie von 1952 bis 1969 als Cellist Mitglied der Wiener Symphoniker. Parallel dazu Studium der musikalischen Aufführungspraxis der Renaissance und des Barock. 1953 Gründung eines eigenen Ensembles (Concentus Musicus) mit seiner Frau, der Geigerin Alice Hoffeiner. Tourneen in England und USA. 1971 Beginn der Einspielung des gesamten Bach-Kantatenwerks (Dauer 20 Jahre) gemeinsam mit Gustav Leonhardt. Ab 1976 — mit Jean Pierre Ponelle — Einstudierung eines Monteverdi-Werkzyklus' mit einem Barockensemble des Züricher Opernorchesters.

Mit seinem Mozart-Zyklus (ab 1980) geht der Dirigent und Musikforscher Harnoncourt ungewohnte neue Wege der Interpretation alter bzw. klassischer Musik, die er in der Folge weiter ausbaut: 1988 in Hamburg: Fidelio, 1989 in Wien: Cosi fan tutte, 1990: Zigeunerbaron, 1992 in Salzburg: Missa solemnis, 1993: eigene Neufassung von Monteverdis "L'Incoronazione di Poppea". Buchveröffentlichungen u.a.: "Musik als Klangrede" (1982), "Der musikalische Dialog" (1984). Schallplattengesamtaufnahmen der geistlichen Bachkantaten, aller Beethoven-Symphonien sowie, unter vielen anderen, Werken von Schubert, Schumann, Brahms und Bruckner.

1980 Erasmus-Preis, 1983 H. G. Nägeli-Medaille, 1987 Ehrendoktor der Universität Edinburgh. Seit 1972 Professor an der Salzburger Musikhochschule.